Casi desde su descubrimiento, surgieron evidencias que sugerían que el splicing se lleva a cabo durante la transcripción, hoy finalmente se probó de manera directa, en fracciones aisladas de cromatina, que los exones tanto constitutivos como alternativos son incluídos en el transcrito durante su síntesis.
La remoción de los intrones y la ligación de los exones de los pre-mRNAs es un evento crucial de la expresión génica. El punto central del trabajo de Pandya-Jones y Black (1) publicado el 9 de noviembre pasado es que este mecanismo, denominado splicing, ocurre durante la síntesis de los transcritos. Ya en 1981 Beyer y cols. (2) habían analizado las micrografías electrónicas de unidades transcripcionales embrionarias de la mosca de la fruta, encontrando que las partículas de ribonucleoproteínas que se reclutan en los sitios de splicing (ss), y la formación del intermediario de splicing (el lazo), se sujetaban al templado de DNA en la cromatina.
Pandya-Jones aisló los núcleos de dos líneas celulares humanas que llevan a cabo el splicing de dos pre-mRNAs distintos, el de la fibronectina (FN) y el de la tirosina cinasa (c-Src), de manera diferencial. Después trató estos núcleos con urea y un detergente no iónico liberando al nucleoplasma las proteínas y el RNA asociados débilmente a la cromatina (compuesta de templado de DNA, Polimerasa II y del transcrito naciente de RNA), esto sin causar la disrupción de los complejos de transcripción. Así, analizando la estructura de los RNA presentes en ambas fracciones, cromatina y nucleoplasma, Pandya-Jones pudo cuantificar la cantidad de splicing para cada exón de FN y de c-Src ocurre durante la síntesis del RNA. Las mediciones se llevaron a cabo por medio de ensayos cuantitativos de retrotranscripción acoplada a reacción en cadena de la polimerasa (qRT-PCR), comparando las uniones exón-exón con su contraparte sin procesar (exón-intrón) a partir de las moléculas de RNA purificadas de cada fracción. La elección de los genes modelo fue cuidadosa porque éstos poseen números distintos de exones constitutivos y alternativos y de longitudes de intrones distintas. Esta elección también implica el análisis de exones alternativos de diferentes transcritos que son regulados por los mismos factores de splicing: el exón N1 de c-Src y el exón 25 de FN.
La eficiencia de purificación de las fracciones se verificó primero por el análisis de las proteínas contenidas en ellas y segundo, como era de esperarse, confirmando que en la cromatina existe una mayor cantidad de extremos 5' de RNA (transcritos nacientes) comparado con la igual cantidad de extremos 5' y 3' de RNA presentes en el nucleoplasma.
Consistentemente con datos previos, también encontraron que la tasa de remoción de los intrones en la fracción de la cromatina (v.g. cotranscripcionalmente), decrece hacia los extremos 3' de los transcritos. Asimismo y novedosamente, encontraron que los intrones que flanquean a exones alternativos son removidos durante la transcripción, independientemente de qué intrón, río arriba ó río abajo, del exón alternativo, se elimina primero.
Es difícil reconciliar todas las evidencias encontradas por Pandya-Jones con los modelos propuestos para explicar cómo la maquinaria de transcripción afecta los patrones de splicing. Por un lado, los intrones río abajo de los exones 25 y 33 de FN son removidos antes que los intrones río arriba aún y cuando los factores involucrados en dicho splicing son distintos. Por el otro, los intrones de dos exones que comparten los mismos factores de splicing, 25 de FN y N1 de c-Src, se remueven en un orden distinto. En conclusión, estos datos significan que el mecanismo de remoción de los intrones puede ser variable de una célula (y contexto) a otra(o), pero la constante es que el splicing siempre ocurrirá asociado a la maquinaria transcripcional.
Lectura adicional:
Pandya-Jones A and Black DL. 2009. Co-transcriptional splicing of constitutive and alterntive exons. RNA, 15:1896-1908.
Beyer AL, Bouton AH, Miller OL Jr. 1981. Correlation of hnRNP structure and nascent transcript cleavage. Cell, 26:155-165.
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