El splicing es uno de los mecanismos principales involucrados en la regulación de la expresión génica, y consiste en la remoción de los intrones seguido de la ligación de los exones generando así un RNA mensajero maduro con sentidd
o codificante. Tal remoción de los intrones requiere de una variedad de factores constitutivos de splicing así como de secuencias de nucleótidos específicas del propio RNA.
Aproximadamente el 75% del genoma humano consiste de genes interrumpidos por intrones y múltiples exones alternativos, que generarán muchas variedades de mensajeros, y por tanto de proteínas, a partir de un solo gen. Además, la mitaa
d de las enfermedades genéticas humanas, y algunos tipos de cáncer, están asociadas a defectos de splicing o a eventos de splicing aberrante. En este sentido, es comprensible que la regulación de los eventos de splicing alternativo
requiera de la actividad de factores auxiliares de splicing que activan o inhiben la inclusión de un exón.
Entre las proteínas activadoras se encuentran las proteínas SR en tanto que entre las proteínas inhibidoras se encuentran las proteínas hnRNP. Ambos tipos de proteínas constan de uno o dos dominios de unión a RNA (RRM y de homologg
ía K), que reconocen secuencias específicas de RNA con una afinidad moderada. Las proteínas SR por su parte activan el splicing por medio de su dominio rico en Arginias-Serinas (RS) que interactúan con otros factores de splicing. Poo
r otro lado, el dominio rico en Glicinas (Gly) de las proteínas hnRNP inhibe la interacción de otros factores de splicing inhibiendo la inclusión de exones.
Considerando los avances en Ingeniería Genética, sería formidable contar con proteínas sobre diseño que contase con dominios de unión a RNA que pudiesen reconocer cualquier secuencia de RNA así como con dominios de activación o
de inhibición de splicing de modo que pudieran aliviar defectos de splicing o corregir eventos de splicing aberrantes. Luca Cartegni y Adrian Krainer [1] abrieron la puerta para explorar estas
posibilidades por el uso de activadores sintéticos de splicing consistentes en fragmentos de DNA unidos covalentemente a dominios RS. Así, los fragmentos de DNA fueron capaces de enlazarse a secuencias mutantes de RNA en células cancc
erosas y corrigieron el defecto de splicing mediante el domino activador, eliminando el carácter canceroso de las células tratadas. Ahora, el grupo de Zefeng Wang, del Departamento de Farmacología de la Escuela de Medicina de la Univv
ersidad de Carolina del Norte y colaboradores dieron los pasos siguientes en la ingeniería de dichos factores [2].
Para lograr un factor de splicing con especificidades prediseñadas, utilizaron el dominio PUF de unión a RNA de la proteína Pumilio 1 humana, y otros dos dominios PUF con especificidades diferentes, fusionados a una señal de direccii
onamiento nuclear y a un dominio activador RS del factor de splicing ASF/SF2 o a un dominio inhibidor Gly de hnRNP A1. El dominio PUF de Pumilio 1 consta de ocho repetidos PUF que reconocen 8 bases constitutivas del RNA con gran afinidad, mayor a la de los dominios RRM y de homología K. Los repetidos PUF pueden ser modificados para reconocer prácticamente cualquier secuencia de RNA y éstos clonados en fase con diversos dominios RS o Gly pueden activar o inhibir prácticamente cualquier exón en cualquier transcrito naciente.
Los factores de splicing así diseñados, inhibieron o activaron, según el caso, en sistemas de prueba en ensayos de splicing in vivo. Es decir, los genes de los 6 factores de splicing sobre diseño se introdujeron en una de las tres cc
élulas portadoras de sendas construcciones reporteras con secuencias blanco para ellos e, ingeniosamente, cada juego de proteínas y construcciónes reporteras sirvieron de testigos negativos de los otros juegos.
Wang y colaboradores también probaron que la activación del splicing se lograse seleccionando sitios alternativos de splicing localizados tanto río arriba como río debajo del sitio de reconocimiento de los dominios PUF y además conn
struyeron otros factores sobre diseño utilizando los dominios RS y Gly de otras proteínas obteniendo los mismos resultados.
Pero el sistema es todavía más robusto ya que puede modular el splicing de genes de células "en la vida real". Los autores eligieron modificar el splicing del pre-RNA mensajero de Bcl-X, que puede ser procesado en dos productt
os con funciones opuestas: la forma larga Bcl-xL, codifica a un potente inhibidor de la muerte celular programada (es decir, apoptosis) que esta presente en células inmortales y esta sobre-expresada en células cancerosas; por otra parr
te, la forma corta Bcl-xS, es pro-apoptótica provocando que la división de las células que las expresan sea altamente regulada. Para estimular la expresión de Bcl-xS (es decir, inhibir la expresión de Bcl-xL), Wang y colaboradores
expresaron un factor de splicing sobre diseño con un dominio PUF que reconoce un segmento de RNA intermedio entre los sitios de splicing 5' que compiten entre las dos formas, dominio que esta fusionado al dominio inhibidor Gly. El
factor así diseñado estimuló la expresión de Bcl-xS en tres tipos de células cancerosas y como resultado de dicha expresión esas células cancerosas aumentaron su porcentaje de apoptosis y se tornaron más sensibles a las drogas aa
ntitumorales.
En resumen, el trabajo de Wang y colaboradores promete el diseño casi universal de factores de splicing a la carta.
Lecturas recomendadas:
1. Cartegni, L. y Krainer, A.R. (2003) Correction of disease-associated exon skipping by synthetic exon-specific activators. Nat Struct Biol, 10, 120-125.
2. Wang, Y., Cheong, C.G., Hall, T.M. y Wang, Z. (2009) Engineering splicing factors with designed specificities. Nat Methods, 6, 825-830.
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